Les campagnes militaires auxquelles il participa furent un champ d’expériences et d’innovations extraordinaire. Le développement des armes à feu et les blessures qu’elles occasionnaient impliquait des traitements inédits ou à améliorer. C'est ainsi que le hasard força le jeune barbier à remettre en cause des siècles de thérapie brutale et inefficace. Les amputations – qu’il traita en ligaturant les artères sur leur cautérisation -, les trépanations, luxations (il pratiqua la première désarticulation du coude), plaies diverses qu’il soigna avec succès lui taillèrent une réputation de virtuose.
Réputation qui le fit être engagé au service de René de Rohan, d’Antoine de Bourbon (père d’Henri IV) puis d'Henri II qui l'admit au nombre de ses chirurgiens ordinaires. Ambroise Paré fut ainsi le chirurgien des rois jusqu’à Henri III.
Parmi toutes ses nombreuses observations qui l’amenèrent à innover on peut citer l’asticothérapie, de nos jours redécouverte et développée.
Selon J.-P. Poirier, la principale originalité d'Ambroise Paré fut la conception exigeante qu'il eut de sa profession, tant sur le plan technique que sur le plan humain, conception au service de laquelle il sut mettre un véritable génie de la communication qui l'amena, par exemple, à publier ses livres en français.