De 1542 à la fin de sa vie, tout son travail va se concentrer sur la traduction des œuvres de Plutarque, allant jusqu’à consulter les manuscrits italiens à la Vaticane (bibliothèque du Vatican).
Dans un 16ème siècle qui aimait chercher ses belles pensées et ses grands exemples dans l’Antiquité, l’œuvre d’Amyot remporta un vif succès d’autant qu’elle se répandit auprès d’un large public. Traductions, certes revisitées parce qu’il refusait résolument les tours savants, les néologismes, les hellénismes. Son but ? Mettre à la portée de ses contemporains l’enseignement moral du philosophe grec. S’étant juré d’écrire dans un français libre de toute tutelle, pour intéresser le lecteur de façon plaisante à l’érudition de l’auteur antique, il va comme recréer Plutarque dans une langue pleine de fraîcheur, merveilleusement riche mais qui devait plus au parler commun du peuple qu’à l’érudition. Ainsi soumit-il au bon sens toutes les fantaisies de style passées et du moment.
Nommé précepteur des enfants de France, les futurs Charles IX et Henri III, à l’avènement de Charles IX, il fut nommé grand aumônier de France (1560), conseiller d’Etat puis conservateur de l’université de Paris.
Quel regard pouvons-nous porter de nos jours sur ces puits d’érudition, références qui nous semblent bien surannées ? Si au siècle suivant certains le décrièrent comme plagiaire, il garda ses fidèles tels Vaugelas, Racine, La Bruyère et même Rousseau qui apprit à lire dans ses textes. Très rares sont ceux qui purent s’affirmer comme écrivains de premier rang par leurs seules traductions : Jacques Amyot fut de ceux-là.
Evêque d’Auxerre depuis 1570, il vécut là dans la tranquillité, occupé à la réfection de la cathédrale malamenée par les protestants et à ses traductions, quoique perturbé vers la fin de sa vie par l'insubordination et les révoltes de son clergé. Ecclésiastique pieux et consciencieux, il s'en tint courageusement à ses principes.
Sentant sa fin approcher, ce prélat amateur de musique s’empressa d’avoir recours aux sacrements de l’église, et mourut en présence d’un grand nombre de prêtres et de fidèles. Dans le respect de son testament, il fut inhumé vis-à-vis le grand autel de la cathédrale, à côté du trône pontifical.
Sa tombe fut profanée à la Révolution. Il en reste son effigie dans le choeur de la cathédrale à proximité de sa sépulture disparue.